干货分享：PCR体系构建“酶”有选择

  PCR反应中涉及到不一样的种类的酶，如何通过你自己的试验需求来做选择是在试验之初值得思考的问题，下面小编就带大家一起了解一下PCR实验中几种常见的酶。

  聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，能将微量的DNA大幅度的增加。整个PCR反应过程中有几种不可或缺的物质，酶就是这里面一种。不同的酶有不同的试验特性，根据其特性又能应用在不同的场景中。如何明智的选择试验中最适合的酶是我们在试验之初值得思考的问题，下面小编就带大家一起了解一下PCR实验中几种常见的酶。

  DNA聚合酶PCR试验之初使用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，但由于每一个循环都需要补充新的酶，其操作步骤稍显复杂。1988年科学家们从水生栖热菌中分离得到了Taq DNA聚合酶，从此DNA的自动扩增变成现实。也是由于这个酶的发现使PCR成为了一项便利、实用、普遍的技术。Taq DNA聚合酶也成为了DNA试剂盒中最常见的一种聚合酶。

  野生的Taq DNA聚合酶虽然已经具备良好的功能性以及广泛的应用场景范围，但由于分子诊断技术方面的要求的精确性及各项要求慢慢的升高，因此对其扩增能力、保真性、耐热性等方面做优化。来提升Taq DNA酶在分子诊断中的稳定性、灵敏度以及特异性。

  良好的耐热性，最适催化浓度为75-80℃，95℃半小时后仍保留50%以上的活性。

  有5’-3’外切酶活性，TaqDNA酶也是少数具有这一特性的DNA聚合酶之一。

  可以在PCR产物3’末端添加无模板核苷酸，这一特性可以使TaqDNA酶的PCR产物直接用于TA克隆。但它没有3’-5’的校正活性，可能在PCR反应中引起错配，这一

  聚合酶为了尽最大可能避免因错配而出现的非特异性扩增，造成试验结果不准确，科学家们对Taq DNA聚合酶进行了修饰。而PfuDNA聚合酶正是利用了酶的修饰物在常温下抑制DNA聚合酶活性，加热至变性温度时修饰物失活，释放酶活，从而使PCR反应得以正常进行。它可以很好地弥补Taq DNA聚合酶的劣势，有效提高目标基因的扩增成功率，因此应用场景范围较广。目前市面上常用的PfuDNA聚合酶修饰方法主要有化学修饰法、配体修饰法和抗原抗体结合法，修饰原理不同其优劣势各有不同。

  化学修饰法利用化学小分子和DNA聚合酶活性中心结合封闭酶活，当温度为95℃的时候酶活性释放。

  适配体（一般指一类具有特异性识别功能的单链核酸分子，DNA或者RNA）通过非共价键作用与聚合酶结合封闭酶活。当温度高于60℃酶活性释放。

  ：由于核酸适配体是一种可逆抑制剂，较化学修饰法来说稳定性较低，特异性不够强。

  抗原抗体结合法是当前最常用的一种方法，利用DNA聚合酶抗体与聚合酶进行结合封闭酶活性，当温度到达变性温度时（95℃）开始释放酶活性，可以大幅度避免错配或引物二聚体引起的非特异性扩增。另一方面针对低丰度基因，封闭抗体在避免预变性前的DNA聚合酶和模板的非特异性结合的同时，增加了引物与微量的正确模板碰撞退火的效率，来保证低丰度基因的有效检出，极大的提升反应灵敏度和扩增效率。

  1970 年Temin发现了逆转录酶，该酶以RNA 为模板，以dNTP 为底物，根据碱基配对的原则，按5-3方向合成一条与RNA 模板互补的DNA 单链。

  逆转录酶具有依赖于DNA或RNA模板的DNA聚合酶活性，因此没有3’-5’外切酶活性。但其具有RNase H活性，在某些特定的程度上限制了逆转录酶的合成长度。由于野生逆转录酶的保真性和热稳定性较低，因此科学家们对其进行了改造。

  常见的逆转录酶主要有HINV1 RT、AMV RT、M-MLV RT，但由于前两种酶的应用场景范围较窄，因此研究者们主要是针对最后一种逆转录酶不断进行升级改造。升级后的第三代逆转录酶整体性能有了明显的提升，表现在有更高的cDNA产量、更广的温度范围以及可以适用于复杂结构RNA模板，提升了cDNA的合成长度。虽然第四代的性能更好，但由于其价格过高，实际应用并不广泛。

  链置换DNA聚合酶1972年Stenesh和Roe首次从嗜热脂肪芽孢杆菌中分离了Bst链置换DNA聚合酶，与Taq DNA聚合酶有相似的结构域。经基因工程改造去除了DNA聚合酶Ⅰ的 5’-3’核酸外切酶活性，但保留了 5’-3’ DNA 聚合酶活性和强链置换活性。

  其缺点为不具有5′→3′外切核酸酶活性，因此没有纠错功能。不同的酶由于优劣势各有不同因此其常见的应用场景也各有侧重。Taq DNA聚合酶的应用场景范围十分的广泛，可应用于常规PCR扩增、易错PCR扩增、位点特异性PCR、RT-PCR、qRT-PCR，同时也是探针法qPCR技术的指定聚合酶；使用热启动Taq酶是提升PCR特异性的常用方法，因此热启动Taq酶常用于qPCR反应中，除此之外，由于其较高的特异性和高灵敏度，也经常被用于构建DNA文库、DNA测序、突变体的分析构建、基因分离、遗传病诊断、法医鉴定等；逆转录酶可以为qPCR合成第一链cDNA，有构建cDNA文库、DNA测序、末端标记DNA等作用；Bst链置换DNA聚合酶适用于较低温度下（68℃）的DNA测序、防污染的等温扩增反应，如 LAMP 等。

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